همسانه سازی سازه خاموشی ژنt6odm (thebain 6-0 - demethylase) و معرفی دائم و موقت آن در گیاه دارویی شقایق

چکیده: شقایق مهمترین منبع چندین آلکالوئید دارویی مانند ضد درد، سرفه، تومور و باکتری است. با آنکه اصلاح سنتی به خوبی دیگر روش های مولکولی تعداد زیادی ژرم پلاسم با میزان آلکالوئید های تغییر یافته تولید کرده است، ولی هنوز نیاز به دستورزی مسیر های بیوسنتزی این آلکالوئید ها به روش های مهندسی ژنتیک می باشد. ژن t6odm thebaine – 6 - o demetylase)) یکی از ژن های پایین دست مسیر بیوسنتز آلکالوئید ها می-باشد که تبائین را در موقعیت 6 دمتیله کرده و به نئوپینون تبدیل می کند که نئوپینون خود طی یک واکنش دیگری به کدوئینون تبدیل می شود. همچنین این ژن در مسیر دیگری اوریپاوین را دمتیله کرده و به مورفینون تبدیل می کند. در این پژوهش به منظور بررسی تأثیر خاموشی ژن یاد شده بر میزان بیان آن، دو سازه خاموشی موقت و دائم متکی بر فن rnai طراحی و ساخته شد و سپس توسط اگروباکتری به گیاه شقایق وارد شدند. جهت خاموشی پایدار از سازه سنجاق سری ژن هدف و از ناقل pgsa1285 استفاده گردید و سازه یاد شده توسط اگروباکتریی به ریزنمونه های محور زیرلپه منتقل شد. برای همسانه سازی سازه خاموشی موقت (vigs; virus induced gene silencing) ژن هدف از ناقل ویروسی ptrv استفاده شد و توسط اگروباکتری به برگ های گیاهچه های 3 تا 4 هفته ای تراریزش شد. در بررسی خاموشی موقت ژن t6odm ابتدا گیاهان تیمار (تلقیح یافته با (trv+t6odm و گیاهان شاهد (تلقیح یافته با trv خالی)، جهت اثبات تراریزش، مورد ارزیابی حضور ژن پروتئین پوششی (cp) ناقلtrv قرار گرفتند. در مرحله بعد از میان گیاهانی که trv مثبت بودند تعدادی گیاه جهت آنالیز نیمه کمی انتخاب شدند. سپس نمونه هایی که کمترین سطح بیان را نشان دادند، جهت آنالیز دقیق تر بیان ژن با استفاده از فن بیان ژن در زمان واقعی مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج نشان داد که میانگین درصد خاموشی در گیاهان ترارریخت انتخابی نسبت به گیاهان شاهد حدود 73 درصد می باشد. از این رو کارایی سازه مورد نظر جهت کاهش قابل توجه بیان ژن مورد تأیید قرار گرفت. در این پژوهش به منظور بهینه سازی شرایط کشت بافت و باززایی ریزنمونه های تلقیح یافته، آزمایش دیگری به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با هشت تکرار (هر پتری دیش به طور متوسط شامل 10 ریزنمونه به عنوان یک تکرار) انجام شد. فاکتور های مورد بررسی شامل نوع محیط کشت پایه (b5 و ms) و سطوح آنتی بیوتیک پارامومایسین ( 5، 10 و 15 میلی گرم بر لیتر) بودند. نتایج نشان داد در مرحله تولید کالوس از ریزنمونه های تلقیح یافته، محیط ms محیط مناسب تری است. همچنین در غلظتهای پارامومایسین سطوح 5، 10 و 15 میلی گرم بر لیتر باززایی گیاهچه مشاهده شد ولیکن به تناسب افزایش غلظت آنتی بیوتیک درصد باززایی سیر کاهشی داشت. کلمات کلیدی: آلکالوئید، پارامومایسین، خاموشی، محور زیرلپه، pcr در زمان واقعی، .vigs